摘要将实验材料菊花茎段改为本实验室易得的烟草叶片，并且优化人教版选修1教材中MS培养基的配制方法，这样实验可操作性强，学生可观察到生长素、细胞分裂素诱导烟草叶片分化的明显实验现象，教学效果好。菊花苗批发基地

关键词植物组织培养实验材料方法

在普通高中《生物课程标准》(实验)的《生物技术实践》模块中，植物组织培养的具体要求是“尝试植物的组织培养”。尝试是技能性目标中的模仿水平，即学生仿照教师的示范性动作完成对实验对象的操作。

植物组织培养是一项操作难度较大的实践活动，其操作流程包括：配制母液、制备MS固体培养基、外植体消毒、接种、培养、移栽、栽培等操作环节。在实际操作中难以一次完成，又由于所教的班级多，实验材料——菊花，本地购买也不方便，所以，对“菊花的组织培养”实验的材料和方法步骤及实验设计都进行了改进，从而使实验可操作性增强，效果变好，并且将实验内容分为两个，一周做一个，保证能在有限的时间内顺利地开展实验教学。

1实验一：MS培养基的配制

1.1实验原理

MS培养基的成份分为四大类：大量元素、微量元素、有机物和植物激素。培养基根据培养目的，可加入不同种类及浓度的激素即生长素类和细胞分裂素类，而且植物激素的浓度、使用的先后顺序及用量的比例等，都会影响实验的结果。但由于班级多，仪器数量有限，只尝试了加植物激素和不加植物激素两种条件下烟草叶片长出愈伤组织的情况。

1.2实验仪器、药品

电脑程控压力蒸汽灭菌锅(长春百奥)，微波炉，天平，三角瓶(200mL和500mL)，烧杯，量筒，量杯(500mL和1000mL)，橡皮筋，封口膜，报纸，移液管，玻璃棒，普通水浴锅，精密pH试纸。

NAA母液1mg／l，6-BA母液1mg／L，培养基母液，pH试纸，琼脂粉，蔗糖，蒸馏水。

 

1.3实验步骤

1.3.1实验设计

1.3.2配置各种母液

大量元素20倍：用天平(按人教版选修一教材第84页中关于MS培养基的内容)取药品，分别加600mL左右蒸馏水溶解后，再用玻璃棒搅拌，促进溶解。注意CaCl2不易溶解，单独溶解后再倒入1000mL量杯中，再加蒸馏水定容至刻度，成为20倍母液。

微量元素200倍：用天平按表称取药品后，分别溶解，混合后加水定容至1000mL。

有机物200倍：按表分别称取药品，溶解，混合后加水定容至1000mL。

铁盐母液500倍：按表称取药品，加热促进溶解，混合后加水定容至1000mL。

萘乙酸母液(NAA)1mg／mL：用少量1N NaOH溶解后，蒸馏水定容。

6－苄基嘌呤母液(6－BA)1mg／mL：用少量1N HC1溶解后，蒸馏水定容。

五色草提醒配制好的母液瓶上应分别贴上标签，注明母液名称、配制倍数、日期及配1L培养基时应取的量，并放入4℃冰箱内低温保存，用时再按比例稀释。贮藏期间如发现有霉菌污染或有沉淀结晶产生，就必须丢弃不用。

1.3.3配制培养基

(1)将各种仪器(量杯、量筒、烧杯、移液管、玻璃棒等)、蒸馏水、橡皮筋、封口膜等放置在实验台上。

(2)称量好所需要的琼脂粉(8g/L)、蔗糖(30g/L)。

(3)取1000mL量杯(配置1000mL培养基)，加入600mL左右蒸馏水，30g蔗糖，大量元素贮存液50mL，微量元素和有机物贮存液5mL，铁盐贮存液2mL。

(4)加生长素NAA 200μL(终浓度为0.2mg／L)，细胞分裂素6-BA 2mL(终浓度为2mg／L)。

(5)用1N盐酸和1N氢氧化钠调pH至5.8，并用玻璃棒搅拌均匀。

(6)添加蒸馏水至刻度，定容至1000mL。

(7)将称量好的琼脂粉1.6g倒入200mL三角瓶中。每瓶120 mL(注意不要粘到瓶口和瓶壁上)。

(8)用封口膜封口，橡皮筋缠好，贴标签或用记号笔写明培养基编号，组别。

(9)高压灭菌，将三角瓶摆放在高压蒸汽灭菌锅的筐里，上面覆盖一层报纸，121℃蒸汽灭菌20min。

(10)灭菌结束后，待温度降到90℃以下取出三角瓶，放在实验台上，放置一周备用。同时，为接种所需的无菌水，滤纸，镊子和剪刀等也一并灭好菌。

 

2实验二：外植体消毒，接种和培养

2.1实验原理

离体的植物组织或细胞，在培养了一段时间以后，会通过细胞分裂形成愈伤组织。由高度分化的植物组织或细胞产生愈伤组织的过程，称为植物细胞的脱分化。脱分化产生的愈伤组织继续进行培养，又可以重新分化成根或芽等器官，这个过程叫做再分化，在这个过程中，往往要使用植物激素，人为地控制细胞的脱分化与再分化。

2.2实验材料、仪器和药品

烟草，无菌操作台，组培室，光照培养架，长柄镊子，解剖刀，三角瓶，滤纸，70％酒精棉球，500mL喷壶，酒精灯。

10％安替福民(次氯酸钠溶液)，95％乙醇，70％乙醇，无菌水。

2.3实验步骤

(1)用70％酒精棉球将无菌操作台面擦一遍，70％酒精喷雾使操作台内外环境消毒，开启超净工作台，紫外线照射消毒30min，通风30min，将滤纸，长柄镊子，解剖刀，三角瓶，95％乙醇等放在操作台上。

(2)加热融化灭过菌的培养基，倒入培养皿中，每皿约20mL，半敞口冷却凝固。

(3)取烟草幼嫩的叶片，自来水冲洗表面灰尘15min，放入10％安替福民溶液中3～5min，取出后，无菌水冲洗一次，移入无菌操作台。

(4)在点燃的酒精灯附近，用无菌水再冲洗两次后，灭菌滤纸吸干烟草叶片表面水分，首先将叶缘和叶柄切掉，然后将叶片切成0.5cm左右的小块。

(5)长柄镊子蘸95％酒精后在酒精灯火焰上灼烧灭菌，冷却后将材料接种到培养基中，每皿6～10块。

(6)菊花基地建议在培养皿标签上注明接种日期，并放置在组培室内，光照培养架上培养，温度25+2℃，光照强度为3000lμx，光／暗周期为16h／8h。两周后可以看到明显的实验现象。

3讨论

在本实验中，可将实验分为两部分，使实验步骤详细化，优化MS培养基的配置方法：

(1)实验过程中将传统的琼脂胶改为琼脂粉，省掉了加热融化的步骤，同时也增加了学生实验的安全系数，节省了时间。

(2)与原教材相比，将定容过程放在调节pH之后，减少了实验误差。

同时还将实验材料改为本实验室易得的烟草，易于培养，并且按照教师设计的培养基，用植物激素诱导，学生看到了明显的实验现象，充分理解了植物激素的作用，收到了良好的教学效果。